几种抗原修复法的简单介绍

抗原修复就是利用虎穴试剂盒热的作用将抗原重新暴露出现或修正过来的过程。

常用抗原修复法介绍：

1. 真空负压抗原修复法：

① 切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预先调至95℃，真空负压处理10分钟。

⑤待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的年免疫组化染色方法进行染色。

这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。该法的最大的特点有四：一是各物质的分子在失重的情况下四处飘游，增加各分子间的碰撞机会；二是有恒定的温度，既能使甲醛固定的蛋白发生变性，又不需要使抗原修复液达到沸腾，不会导致切片因抗原修复液的沸腾而离开载片，保证了染色的成功率，减少了因掉片而反复制片的麻烦，保证了病理报告的及时发生，为病人争取更多的时间；三是不受条件限制，不管是金属性的不是非金属的都可以进行操作；四是可以一次性制作大批的切片。

2.微波辐射抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④ 0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。

⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

该法与上法相比，从实验结果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。当然，光靠微波的作用是不够的，还必须依靠热的作用，方能达到目的。应用微波辐射，它有双重作用，微波辐射可以使各物质分子作极性运动。促进形成的醛键断裂开。分子间运动所产生的瞬间热，当达到有效的温度后，就可导致甲醛固定后的蛋白的变性。该法的特点是：产热迅速，容易操作，也容易引起抗原修复液的沸腾，使用微波炉时禁止使用金属性的器皿，以防引起失火或爆炸。

3.高压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。

⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。

该法高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度已达121℃左右。该法被应用于一些较难修复的抗原，经多次实验认为，该法效果不错。

4.隔水热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃↑）。即开始计时，持续40分钟。

⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。

该法应用隔水热方法，效果不及前面三种方法，它需要较长时间的热的作用，在早期应用于Er和Pr染色的抗原修复时，我们的修复时间为40分钟，如果达不到这时间，效果将不理想。

5.电炉加热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④ 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。

⑤待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。

对各种抗原修复方法的评价。

该法是在没有上述的设备时才选用的一种方法，当然效果是最差的，因为它只是单靠热的作用，这是远远不够的，另外，电炉加热必须常用温度计来测量温度，对其温度不好控制，有时需要多次关闭电源来维持所需的温度。

抗原修复的方法选择

抗原修复关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。不适当的抗原修复方式会导致染色弱阳性。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。不适当的抗原修复方式会导致染色弱阳性。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞 间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。用于IHC消化的酶很多，所选酶的种类，使用的浓度，PH值，消化时间及温度等均要 视组织固定的不同，所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，应通过预实验摸索确定。使用酶消化的原则：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原，如 Keratin，CEA，GFAP等。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化，如 fibronectin，Laminin，各型胶原等。消化时间和组织固定的长短呈正比。 在 用酶消化，热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法，有时会取得较为满意的结果。一般蛋白酶K和微波相结合，但应注意，可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应。以高压加热方法、微波加热方法较为稳定, 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。 缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCL较常用。

免疫组化抗原修复法的注意事项：

1、pH的应用范围及选择

抗原修复液的pH非常重要，有效的抗原修复pH要比修复液的化学成分更重要，同样的修复液随着pH的升高染色的强度逐渐增强，但最佳pH范围为6.0-10.0。目前大家公认的最好的抗原修复液是pH6.0的柠檬酸盐缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液。作为通用修复液碱性pH的修复液要比酸性的有效，而对固定很长时间旧的存档组织，酸性pH的修复液则优于碱性的修复液。

2、抗原修复时应选择最佳温度

70-90℃的温度对未经固定的蛋白质可发生变性，但经福尔马林固定的蛋白质，温度必须达到92℃以上方能使其变性。研究结果显示，温度为92-98℃是合适的，95℃效果最好。

3、抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的

抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其慢慢地降温，绝对不能为了争取时间，强行用冰块或冷水使其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其他的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。