我现在在做小鼠各种组织冰冻切片，但是切出来的片子总是有很多空泡形成，而且还很容易碎，不知道哪一步除了问题，下面是我的实验步骤：

气体麻醉机麻醉小鼠，

1.先用10ml的生理盐水（预先加热到37oC）；将老鼠，一般是30g，平放在冰块上，从下开始剪切，不能剪到内脏，破胸腔，将心脏暴露，用针尖（头皮针6号，针尖磨钝）小心地插入左心室（尖端靠右，剪破右心室，会有血流出），刚开始要快一点。，可以看到肝变白，还有肺，

2.用50ml的注射器吸10ml的PFA（平时4oC保存，要用时放入碎冰中），一共要注射3管(近30ml)。四肢抽搐，尾巴翘起来，第一管要快一点，但是太快血管会破裂，第二管稍微慢一点，第三管比第二管慢，然后再吸入空气，注射进老鼠体内。此时，四肢僵硬，肝硬肺白。整个灌注过程不到10min。

3．依次剪下老鼠的内脏，心肝脾肺肾和大脑，放入4%的PFA中，4oC保存24h-48h，固定。

沉糖

将内脏放入冰箱保存过夜，24h以上。再用10%，20%，30%的蔗糖溶液浸泡，每一个溶液都要从漂浮浸泡到沉底才可以换下一浓度溶液。第一个浓度大概1-2h，除了肺和心，然后20%的大概过夜，。30%的会好几天。其实在30%的时候不要这么久沉，但是有的时候来不及切片，就一直在4度冰箱30%的浓度保存。中间会换一次30%的蔗糖溶液。用的是pbs配。

然后切片时直接从蔗糖溶液中取出，用滤纸吸干，-20度包埋胶包埋，然后组织都是切大概6um，再片子放到-20度，需要时取出来染色，一般苏木素是20min，1%的盐酸酒精分化2-3s，然后伊红10s。再梯度脱水封片。结果染出来的片子不好看，考多空洞，看不到细胞结构，不知道哪一步骤除了问题.

第一幅图，感觉你的苏木素加的不均匀，看上去上浓下稀，出现汽泡可能是你的组织有冰晶形成；第二幅图感觉还行；第三幅图，细胞明显有问题，（1）是不是你固定的不充分，固定如果不充分还不如不固定；（2）还要考虑下，组织是不是保存不当，发生自溶（像融化的样子）。

看你的操作步骤，个人感觉是没有问题的，组织切片时容易碎，显得很脆，可能你切片太薄了，冰切普遍厚于石蜡的，看有的专家说，沉糖后可以避免组织太脆，我目前也做小鼠组织的冰切实验，但组织都没有经过固定处理，一般都是切片后直接晾干做IHC或免疫荧光.