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小鼠组织的冰冻切片和HE染色

2017-05-25

我现在在做小鼠各种组织冰冻切片,但是切出来的片子总是有很多空泡形成,而且还很容易碎,不知道哪一步除了问题,下面是我的实验步骤:

气体麻醉机麻醉小鼠,

1.先用10ml的生理盐水(预先加热到37oC);将老鼠,一般是30g,平放在冰块上,从下开始剪切,不能剪到内脏,破胸腔,将心脏暴露,用针尖(头皮针6号,针尖磨钝)小心地插入左心室(尖端靠右,剪破右心室,会有血流出),刚开始要快一点。,可以看到肝变白,还有肺,

2.用50ml的注射器吸10ml的PFA(平时4oC保存,要用时放入碎冰中),一共要注射3管(近30ml)。四肢抽搐,尾巴翘起来,第一管要快一点,但是太快血管会破裂,第二管稍微慢一点,第三管比第二管慢,然后再吸入空气,注射进老鼠体内。此时,四肢僵硬,肝硬肺白。整个灌注过程不到10min。

3.依次剪下老鼠的内脏,心肝脾肺肾和大脑,放入4%的PFA中,4oC保存24h-48h,固定。

沉糖

将内脏放入冰箱保存过夜,24h以上。再用10%,20%,30%的蔗糖溶液浸泡,每一个溶液都要从漂浮浸泡到沉底才可以换下一浓度溶液。第一个浓度大概1-2h,除了肺和心,然后20%的大概过夜,。30%的会好几天。其实在30%的时候不要这么久沉,但是有的时候来不及切片,就一直在4度冰箱30%的浓度保存。中间会换一次30%的蔗糖溶液。用的是pbs配。

然后切片时直接从蔗糖溶液中取出,用滤纸吸干,-20度包埋胶包埋,然后组织都是切大概6um,再片子放到-20度,需要时取出来染色,一般苏木素是20min,1%的盐酸酒精分化2-3s,然后伊红10s。再梯度脱水封片。结果染出来的片子不好看,考多空洞,看不到细胞结构,不知道哪一步骤除了问题.

第一幅图,感觉你的苏木素加的不均匀,看上去上浓下稀,出现汽泡可能是你的组织有冰晶形成;第二幅图感觉还行;第三幅图,细胞明显有问题,(1)是不是你固定的不充分,固定如果不充分还不如不固定;(2)还要考虑下,组织是不是保存不当,发生自溶(像融化的样子)。

看你的操作步骤,个人感觉是没有问题的,组织切片时容易碎,显得很脆,可能你切片太薄了,冰切普遍厚于石蜡的,看有的专家说,沉糖后可以避免组织太脆,我目前也做小鼠组织的冰切实验,但组织都没有经过固定处理,一般都是切片后直接晾干做IHC或免疫荧光.