免疫组化图片的分析原理及实践

免疫组化技术是当今广泛应用的检测组织切片内特定蛋白的实验手段。利用图像分析软件来判读切片图像上蛋白表达程度是随着软件技术的发展逐步应用到免疫组化技术中的。

组织上的蛋白表达程度，在图片上表现为免疫染色的深浅及面积大小。用肉眼只能定性地进行判读，最多粗略地作一个主观的分级评价。使用图像分析软件则可以对图片染色的程度作一个定量的测量。这个测量结果与切片上的蛋白表达强度有理论上的线性相关性。所以能客观定量地反映它。

在图像分析的方法中，使用灰度来表示一个点的明暗程度，而图片上一个点的明暗程度是与切片上免疫染色物的“光学密度（OD，Optical Density ）”决定的，再往下追踪一步，就是与组织切片上这个点的蛋白表达程度决定的。这有点类似于分光光度计的情形，比色皿里液体样品的吸光度与液体中吸光成分的浓度相关，符合朗伯-比尔定律。图片上一个点的光密度则与该点上的蛋白表达程度正相关（近似为正比）。所以测量一个点的光密度值，就是在测量这个点上蛋白表达程度的一个相对的量值。

朗伯-比尔定律：A = lg(1/T) = kbC

A为吸光度,T为透射比,是投射光强度比上入射光强度
c为吸光物质的浓度 b为吸收层厚度
请注意：郎伯比尔定律中的指数关系表现在吸光度A与透射率T之间。吸光度A就是光密度OD。它与样品浓度是线性关系。所以图片上光密度值与蛋白表达之间的关系理论上也是线性的。但它与灰度值之间的关系是指数的。因此，测量光密度值能更紧密地与蛋白表达程度相关，而灰度值则类似于透光率，它与蛋白表达程度的关系是朗伯比尔定律的反向的指数关系。这就是我一再强调要测量光密度值的原因。

在分光光度法中，我们需要作标准曲线来定量分析样品的实际浓度，但在组织切片的情形下，是没法作标准曲线的。所以我们只能测量到一个相对值。能对不同点的蛋白表达程度进行比较，但不能测量到这个点的蛋白量具体是多少微克。把一片区域内所有的点的光密度值累加起来，就得到一个积分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。 图片上一片片的染色斑块的深浅与范围反映了切片上的特定蛋白表达的程度，它可以由图片上的积分光密度来相对定量地来表示。

光密度值是一个相对的数值，所以它是没有单位的！所以后面的积分光密度值与平均光密度值都是没有单位的。

这种相对的测量数值对我们设计图像分析方法有直接的影响。我们没法通过图像分析的方法测量出切片上有多少测定的蛋白。只能通过比较的方法来判断实验组样品与对照组样品之间的蛋白表达差异。