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甲醛变性电泳

2018-01-23

甲醛变性电泳

实验原理

提取样品的总RNA后,一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构,因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳,得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。将RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中分离出来,通过加入标准核酸分子(markers)对其进行鉴定,并用于转膜、杂交等。

实验试剂

1. DEPC 水的处理:用量筒量取去离子水2L,在通风橱中,加入2ml DEPC到2L去离子水中,终浓度为0.1%的DEPC。迅速盖上盖子,混匀,然后放在摇床中中速摇荡至少4hr,再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开,15磅灭菌20min。
2. 10×MOPS缓冲液(即10×FA缓冲液): 500ml
0.2mol/L MOPS(3-〔N-吗啉〕丙磺酸)                   

80mmol/L NaAc                                                                 

10mmol/L EDTANa2                                                               

先用400 ml DEPC水溶解20.6g MOPS和4.1gNaAc后,加入10ml 0.5mol/L EDTA,定容500ml。用0.22mm滤器过滤除菌,装入棕色瓶中,室温避光保存。

或0.2mol/L MOPS(3-〔N-吗啉〕丙磺酸)

50mmol/L NaAc

10mmol/L EDTA
用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0,临用时用DEPC水稀释。
3. 1×MOPS电泳缓冲液(即1×甲醛变性胶电泳缓冲液1×running buffer):1500ml 
10×MOPS       150ml 
37%甲醛          80ml 
加水至1500ml,一般在3次电泳结束后需更换此电泳缓冲液。 
4. 5 × 甲醛变性胶加样缓冲液(5×loading buffer): 10ml

预先配制水饱和的溴酚蓝溶液:在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝,加入1ml DEPC水溶解,充分振荡溶解,离心,可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余,上层液体即水饱和的溴酚蓝液。在15ml灭菌离心管中,依次加入以下各种成分:
4.0ml      10 × FA buffer
3.1ml      甲酰胺
2.0ml     100%的甘油
720ul      37%的甲醛
80ul        0.5MEDTA (PH 8.0)

16ul        水饱和的溴酚蓝
100ul      DEPC水
混匀,分装,-20℃保存,常用放4℃保存。

或  甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液(10×): 10
50%甘油 
1mmol/L EDTA 
0.25%溴酚蓝 
0.25%二甲苯氰
5ml甘油、20ul 0.5mol/L EDTA、25mg溴酚蓝、25mg二甲苯氰,加DEPC水至10ml,高压后,4°C保存。

实验设备

1. 电泳设备
2. 紫外灯

实验步骤

1.电泳槽用0.3%H2O2浸泡30min,DEPC水冲洗晾干。 
2.铺胶(40ml) 
       琼脂糖                0.55g   
       DEPC水             36ml 
      10×MOPS         5ml 
      37%甲醛            9ml 
称0.55克琼脂糖加36ml DEPC水,微波炉加热溶解琼脂糖,肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至50-60℃,加9ml 甲醛(37%)和5ml 10×电泳缓冲液,然后灌制凝胶,插入合适长度和宽度的梳子,于室温放置30分钟以上使凝胶凝固。
3.RNA样品处理(以一条泳道为例)一般取0.3 g的总RNA,加入1/5体积的5×加样缓冲液,65℃加热5 min,冰上骤冷,以消除RNA的二级结构。建议上样前在RNA样品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙锭(EB,浓度1.0 mg/mL),而不在胶中加EB,这样电泳后的背景较低。配好的甲醛变性胶先在1×甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15min。RNA样品在5-10 V/cm的电压降下电泳30min。
4.加2.0ml甲醛凝胶加样缓冲液(10×) 
5.加样和电泳 
将凝胶预电泳15min,电压降为5-10 v/cm。随后加样品和标准物,以3-4v/cm电压降电泳,电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处。 
6.电泳结束后,在紫外灯下,仔细测量28S rRNA和18S rRNA至加样孔的距离,并同荧光尺一起拍照,以记录标准物的位置。

注意事项

1.每一泳道至多可分析30mg RNA,通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交,可以检测高丰度mRNA(占mRNA总量的0.1%以上);如待测RNA含量极微,每个泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。 
2. 标准物28S rRNA≥6333 base;18S rRNA≥2366 base;9S兔b珠蛋白mRNA≥710 base。溴酚蓝在前(≥300bp),二甲苯氰FF在后(≥4kb)。