HCMEC/D3(永生化人脑微血管内皮细胞)

一、细胞收到后操作流程

1.收到细胞拿回实验室后,先打开外包装,用 75%酒精擦拭细胞培养瓶表面,放到显微镜下观察细胞状态。因运输问题,细胞会有不同程度影响,先不要打开培养瓶盖,放到培养箱静

置 4 小时左右,以便稳定细胞状态。

2.静置完成后,取出细胞培养瓶,镜检、拍照,记录细胞状态(所拍照片作为后期售后依据)。建议细胞传代培养后,定期拍照、记录细胞生长状态。

3.贴壁细胞:若细胞生长密度超过 80%时,根据情况传代,若细胞未超过 80%汇合度时,可将瓶装的完全培养液移入废液缸中,原瓶(T25 瓶)保留 6-8ml 完全培养液继续培养,直至细胞密度超过 80%以后再进行传代。

4.悬浮细胞:将细胞培养瓶内液体转移至离心管,1000RPM 离心 5 分钟,弃去上清液,管底细胞沉淀加入 10ml 完全培养基吹打、重悬。放入新的细胞培养瓶/皿中培养过夜,根据细胞密度及生长情况分瓶传代。

二、细胞常规培养步骤(请严格遵守无菌操作)

1)复苏细胞:将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入 5mL 培养基混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 5 分钟,弃去上清液,补加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入 6cm 皿中,加入约 6ml 培养基,培养过夜),第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达 80%-90%,即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:

1. 弃去培养瓶中上清液,用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2. 加 1-2ml 消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于 37℃培养箱中消化 1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻轻敲几下培养瓶后加 6ml 完全培养基,轻轻吹打细胞层,尽量把细胞层吹落、吹散。

3. 吹打匀后吸出,在 1000RPM 条件下离心 5 分钟,弃去上清液,补加 1-2mL 培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按 1:2 到 1:4 的比例分到新的含 6ml 培养基的新皿中或者瓶中。

2、对于悬浮细胞,传代可参考以下方法:

方法一:收集细胞,1000RPM 条件下离心 5 分钟,弃去上清液,补加 1-2mL 培养液后吹匀,将细胞悬液按 1:2 到 1:5 的比例分到新的含 6ml 培养基的新皿中或者瓶中。

方法二:可选择半数换液方式,弃去半数培养基后,将剩余细胞悬起,将细胞悬液按 1:2到 1:3 的比例分到新的含 6ml 培养基的新皿中或者瓶中。

3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时,弃去培养基后加入少量胰酶,细胞变圆脱落后,进行离心收集,1000RPM 条件下离心 5 分钟,去除上清,

按冻存数量加入血清及 DMSO,冻存比例为 90%FBS+10%DMSO。

注意事项:

1. 收到细胞后请尽快更换为含10% FBS的新鲜培养基,不建议使用原瓶中运输用培养基。

2. 如签收时出现培养瓶壁破裂,漏液等情况请及时拍照并联系实验室。

3. 细胞任何售后问题,均需拍照存档并及时联系客服。

细胞用途:仅供科研使用,不能用于临床诊断使用,细胞培养需要耐心与细心,希望您能获得一个满意的结果。