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石蜡切片免疫组化实验步骤及常见问题

2017-07-18

石蜡切片免疫组化实验步骤及常见问题

石蜡切片免疫组化实验

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原 (多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究。

根据标记物的不同分为:免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常用。今天主要介绍免疫酶法。

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免疫酶法实验原理

根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子, 其与待检的抗原特异性的结合后,加入底物显色。

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实验步骤

1. 石蜡切片置于 67 ℃ 烘箱中,烘片 2 小时,脱蜡至水,用 pH7.4 的 PBS 冲洗三次,每次 3 分钟(3×3')。

2. 取一定量 pH=6.0 柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档微波处理 10 分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用 PBS 冲洗 2×3'。(注:不是所有的抗体都需要微波修复的,视具体情况而定)

3. 每张切片加 1 滴 3% H2O2,室温下孵育 10 分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗 3×3'。

4. 除去 PBS 液,每张切片加 1 滴相应的第一抗体(相应稀释倍数),室温下孵育 2 小时。

5. PBS 冲洗 3×5'。除去 PBS 液,每张切片加 1 滴聚合物增强剂,室温下孵育 20 分钟。PBS 冲洗 3×3'。

6. 除去 PBS 液,每张切片加 1 滴酶标抗鼠/兔聚合物,室温下孵育 30 分钟。PBS 冲洗 3×5'。

7. 除去 PBS 液,每张切片加 1 滴新鲜配制的 DAB 液(二氨基联苯胺),显微镜下观察 5 分钟。

8. 苏木素复染,0.1% HCl 分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。

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实验特点

1. 在切片加上一抗后,第二抗体标记多聚螯合物酶(HRP)的复合物与一抗结合,在多聚螯合物上有大量的 HRP 分子,使抗原信号有显着的放大,其敏感性较 SABC、SP 法高。

2. 由于多聚物在体内不存在,又不使用生物素,从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色,背景比 SABC、SP 法清晰。

3. 辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上,替代传统方法的 二抗、三抗,减少了实验步骤,且试剂孵育时间短,只需 15 分钟,使得免疫组化方法更简单,实验时间比 SABC、SP 法大为缩短。