FOXO1通过诱导心肌细胞自噬降低氧化自由基对其细胞损伤的分子生物学机制研究

研究背景：冠状动脉粥样硬化是导致心肌梗死的主要病因,心肌梗死后的静脉溶栓和冠脉内支架植入,可以恢复梗死区域的血液供应,但是同时又会导致心肌细胞的缺血再灌注损伤。缺血再灌注导致的心肌细胞损伤主要是由于氧化自由基对其细胞代谢的影响,使心肌纤维化、心脏肥大,最终导致心肌细胞死亡,而以上病理过程最终结局为导致患者心力衰竭和患者死亡。活性氧簇(Overloaded reactive oxygen species,ROS),例如超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等通过氧化应激反应损伤细胞DNA、蛋白和脂肪,从而导致细胞活力降低甚至凋亡,而另一方面,包括AMP活性蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK), Sirts和活性磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶在内的机制可以对抗活性氧簇对心肌细胞的损伤,起到保护细胞功能的作用。长期一定量的Sirts表达诱导心肌细胞抗氧化和凋亡,因此人们认为对于AMP活性蛋白激酶基因敲除的小鼠,AMP活性蛋白激酶缺陷可以促进活性氧簇对于心肌细胞的损伤,综上所述,研究抗氧化应激损伤心肌细胞的通路,对于冠心病缺血再灌注损伤治疗意义重大。F0X01是转录因子FOX0亚家族中的主要成员之一,称为叉头框转录因子。人FOX01基因定位于13号染色体,编码655个氨基酸。FOXO1蛋白包含4个结构域：依次为N端的forkhead区域(此区域同时也是DNA结合域)、核定位信号肽、核输出序列和C端富含脯氨酸和丝/苏氨酸的转录激活域。F0X01基因广泛分布于成人的各组织器官中,如心脏、脑、胎盘、肺脏、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、外周血白细胞中。FOXO1和FOXO3等Forkhead box O转录因子对于处于心肌细胞之外其他的各类细胞分化、代谢和衰老均具有一定的作用。有研究表明,先天性FOXO1或FOXO3缺陷的小鼠通常会发生胚胎血管异常或者继而发生心肌肥厚,特别是近年来发现,FOXO1是维持心肌细胞正常代谢和存活的关键,其主要机制是FOXO1通过Hippo-YAP信号通路降低心肌细胞对抗氧化应激。除了以上外,机体还有其他多种信号通路对抗氧化应激对机体组织细胞的损伤。SIN等研究报道,SIRT1主要通过白藜芦醇作用到FOXO1-相关心肌细胞凋亡信号通路而发挥抵抗细胞氧化自由基的作用。以往研究发现过氧化自由基会损伤细胞导致凋亡和活力下降,FOXOs是诱导细胞功能变化重要的调控因素,例如细胞分化和DNA修复,大量的研究发现,FOXOs家族对于细胞氧化自由基损伤具有重要的调控作用,FOXO1缺乏的造血干细胞对于氧化自由基损伤作用的耐受能力下降,其主要机制可能与FOXO1能活化转录SODs、过氧化氢酶,抗氧化酶和Prx3等抗氧化作用的酶类生成增多,同时,FoxOs会被氧化自由基、过氧化氢催化生成乙酰化或脱乙酰化FOXO蛋白而失去修复作用。磷酸化或乙酰化FOXOs是基因表达修饰的重要的方式,FOXO1活力主要是通过将FOXO1磷酸化后将其转移到细胞质被抑制,而FOXO1的乙酰化能够增强FOXO1的稳定性,具有保护胰腺β细胞损伤的作用或者是通过转录激活Bim来促凋亡。有研究发现,FOXO1磷酸化通过调节FOXO1的活性从而调节细胞生存和凋亡,然而对于心肌细胞如何通过FOXO1磷酸化调节FOXO1的活性尚不清楚。近年来有研究发现,FOXO1具有促进细胞自噬的作用,FOXO1可以通过诱导RAS-相关GTP-binding蛋白RAB7A的表达从而促进细胞自噬,因此,FOXO1是否参与到氧化自由基对心肌细胞损伤的修复中,FOXO1与氧化自由基损伤的心肌细胞的凋亡和自噬的关系如何,有待于进一步的进行研究。因此,本文通过研究FOXO1对于心肌细胞氧化应激损伤的作用,从而揭示FOXO1的功能是诱导氧化应激损伤还是保护损伤的心肌细胞,还是两个兼有。同时进一步研究心肌细胞特异性缺失FOXO1促进氧化应激导致的心肌细胞凋亡的机制和FOXO1过表达通过促进细胞自噬降低细胞凋亡的机制,本研究对于寻找抗心肌缺血再灌注损伤的药物治疗靶点,提高心肌梗死治疗疗效意义重大目的：1.通过过氧化氢培养心肌细胞模拟过氧化自由基对心肌细胞损伤,检测过氧化氢对心肌细胞凋亡的影响,检测FOXO1在蛋白、mRNA以及磷酸化水平的变化。以探讨FOXO1对于心肌细胞氧化应激损伤的作用。2.利用转染技术使FOXO1沉默,用不同浓度FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞,检测FOXO1 mRNA的含量、细胞凋亡比例。在200uM过氧化氢培养后,用不同浓度FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞,检测caspase 3含量、PARP含量、caspase 3活性、自噬囊泡的形成以及及LC3II与LC3I的比值,以探讨FOXO1与过氧化氢培养下心肌细胞凋亡和自噬的相关机制。方法：1细胞系处理方法：培养人类心肌细胞系H9c2,不同浓度过氧化氢培养细胞来模拟细胞受到氧化自由基损伤的模型,将培养好的H9c2细胞放置于0uM、50uM、 100uM、200uM H2O2混合气体中培养24到48小时。2过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测细胞凋亡H9c2心肌细胞用0uM和200uM过氧化氢分别培养24小时和48小时后,用Annexin V-FITC和碘化丙啶对H9c2心肌细胞进行染色,然后用流式细胞分析仪进行细胞凋亡检测,细胞凋亡的结果用凋亡细胞比全部细胞进行表示。3.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测caspase 3和PARP蛋白以及caspase 3活性表达。0uM和200uM过氧化氢分别培养H9c2心肌细胞24小时和48小时,通过蛋白免疫印迹电泳法检测caspase 3和PARP蛋白表达,通过荧光电泳法检测H9c2心肌细胞的caspase 3活性的表达,4.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测FOXO1蛋白水平和FOXO1磷酸化表达OuM、50uM、100uM、200uM过氧化氢培养H9c2心肌细胞后,用蛋白免疫印迹试验检测FOXOI蛋白水平和FOXO1磷酸化表达。5.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测FOXO1mRNA水平表达OuM、50uM、100uM、200uM过氧化氢培养H9c2心肌细胞后,用实时反转录PCR检测FOXO1mRNA水平表达。6.用FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞,使FOXO1沉默通过转染方法沉默FOXOI,用浓度为25nM、50nM的FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞,未用FOXO1-specific siRNA只有脂质体处理的作为对照组。7.FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞后,检测FOXO1mRNA水平表达用25nM、50nM FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞后,用实时反转录PCR检测FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照组FOXO1mRNA水平。8.FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞后,检测细胞凋亡用25nM、50nMm FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞后,用Annexin V-FITC和碘化丙啶对H9c2心肌细胞进行染色,然后用流式细胞分析仪检测FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞组和空白对照组的细胞凋亡。9.200uM过氧化氢培养FOXOl-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞后,检测caspase 3活性以及caspase 3和PARP蛋白表达。200uM过氧化氢分别培养25nM、50nM FOXO1-specific siRNA心肌细胞和空白对照细胞后,通过荧光电泳法检测caspase 3活性的表达,通过蛋白免疫印迹电泳法检测caspase 3和PARP蛋白表达。10.过氧化氢培养FOXOl-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞后,检测细胞自噬0uM和200uM过氧化氢分别培养50nM转染FOX01-specific siRNA心肌细胞和空白对照细胞后,利用绿色荧光蛋白染色观察自噬囊泡,利用绿色荧光蛋白检测仪定量检测GFP-LC3、LC3Ⅱ/LC3I。统计学处理：全部数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,多组间不同组别间差异比较采用方差分析,有统计学意义后进行两两比较,采用LSD进行多重两两比较,两组间比较采用双尾t检验,显著性水平设定为0.05,当P值小于0.05,差异具有统计学意义。结果：1.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测细胞凋亡：随着过氧化氢培养浓度的增加、培养时间的延长,细胞凋亡增加。2.3.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测caspase 3和PARP蛋白以及caspase 3活性表达。随着过氧化氢培养浓度的增加、培养时间的延长,caspase 3和PARP蛋白以及caspase 3活性表达增加。3.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测FOXO1蛋白水平、FOXO1mRNA水平和FOXO1磷酸化表达用OuM、50uM、100uM、200 uM过氧化氢培养H9c2心肌细胞,FOXO1蛋白水平、FOXO1mRNA水平组间差异无统计学意义。与以上规律相反,H9c2心肌细胞在用0uM、50uM、100uM、200uM浓度的过氧化氢培养下,随着过氧化氢浓度的增高,FOXO1的磷酸化水平逐步升高,且差异均有统计学意义,磷酸化程度与过氧化氢浓度呈计量依赖性。4.FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞组和空白对照细胞组FOXO1mRNA的表达FOXO1-specific siRNA转染细胞组FOXO1mRNA的表达低于空白对照细胞组,差异具有统计学意义(P<0.01),随着FOXO1-specific siRNA转染浓度的增大,FOXO1mRNA的含量逐渐减小,组间差异有统计学意义(P<0.01)。5.FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞凋亡检测FOXO1-specific siRNA转染细胞组细胞凋亡高于空白对照组间,差异具有统计学意义(P<0.05),随着FOXO1-specific siRNA转染浓度的增大,细胞凋亡升高,组间差异有统计学意义(P<0.05)。6.200uM过氧化氢培养FOXOl-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞后,检测caspase 3活性以及caspase 3和PARP蛋白表达。200uM的过氧化氢培养下的FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞的caspase3活性以及caspase 3和PARP蛋白表达均高于空白对照组(P<0.05)。随着FOXO1-specific siRNA转染浓度增高而增高,caspase 3活性以及caspase 3和PARP蛋白表达增高,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。7.过氧化氢培养FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞后,检测细胞自噬200 uM过氧化氢可以明显诱导对照组细胞自噬囊泡的形成(绿色荧光蛋白阴性点),200 uM过氧化氢培养下,50nM FOXO1-specific siRNA细胞组自噬囊泡低于对照组(绿色荧光蛋白阴性点),200 uM过氧化氢培养下,50nMFOXO1-specific siRNA细胞组的GFP-LC3、LC3II/LC31低于对照组(P<0.05)。即FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞组降低过氧化氢诱导自噬(p<0.01).结论1.过氧化氢损伤心肌细胞造模成功,并将心肌细胞FOXO1沉默(用FOXO1-specific siRNA转染H9c2细胞)。2.随着过氧化氢浓度的升高和培养时间的延长,心肌细胞凋亡、caspase 3、PARP蛋白水平及caspase 3活性升高,呈剂量依赖性。提示过氧化氢诱导凋亡。3.过氧化氢培养心肌细胞,FOXO1在蛋白和mRNA的水平未发生变化,随着过氧化氢的浓度增高,FOXO1磷酸化水平升高,提示过氧化氢诱导心肌细胞凋亡可能是通过促FOXO1磷酸化,进而抑制FOXO1对心肌细胞的修复作用。4.在200uM过氧化氢培养后,随着FOXO1-specific siRNA转染浓度增高,细胞凋亡比例、caspase 3含量、PARP含量以及caspase 3活性增高。提示FOXO1沉默促进过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡,进而说明FOXO1抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡。5.200uM过氧化氢诱导对照组细胞自噬囊泡的形成,过氧化氢培养FOXO1-specific siRNAH9c2转染心肌细胞,自噬囊泡减少、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低。提示过氧化氢诱导心肌细胞自噬,FOXO1沉默降低过氧化氢诱导的心肌细胞自噬,进而说明FOXO1增强过氧化氢诱导的心肌细胞自噬。