miRNA-21在伊马替尼敏感型胃肠间质瘤中的表达及通过B淋巴细胞瘤-2基位点作用机制研究

背景胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors, GISTs)是较常见的胃肠道间叶细胞瘤,其发病率占整个胃肠道肿瘤的2%,最初在上个世纪60年代,病理学层定义为平滑肌肿瘤或神经源性肿瘤,直到1983年Mazur研究确定以胃肠道间质瘤命名,其命名主要是依据肿瘤的分化特征而提出。胃肠道间质瘤多见于中老年人,40岁以下病人极少见,发病中位年龄为50岁到60岁。一般60-70%多发于胃,20%到30%发生在小肠,只有10%以内发生在食管、结肠和直肠。胃肠道间质瘤在CT上主要表现为T1上肿块实质部分呈低信号,与肌肉信号相当,在T2上呈高信号,肿瘤中央可以发现含气的坏死腔和肿瘤钙化的无信号区域,如果肿瘤中央内出现出血,会出现时间不同的混杂信号。胃部的胃肠道间质瘤占胃部肿瘤的2%-3%,发病部位一般位于胃体,胃窦发病率较低,形态大小不一,大者还可以超过30cm,大多数病变肿瘤瘤体可以向胃外生长,或者向腹膜腔蔓延。生长在小肠的胃肠道间质瘤占整个胃肠道间质瘤的20%,全段小肠均可发生,其中30%的病变多发生于十二指肠,空肠病变多于回肠,通常发生在小肠的胃肠道间质瘤,其肿瘤体积较大,恶性程度较高,其病变一般位于肠腔外,病变多为偏心性,有些小肠壁可见像动脉瘤样扩张,其主要机制是肿瘤引起肠管皱缩及神经丛受损,影像学口服造影剂检查多可以发现肠瘘管,向管腔内生长者,表现为肠梗阻；发生于肛门和直肠的胃肠道间质瘤发病率不足十分之一,一旦发生绝大部分为恶性,其中2/3以上恶性程度高,具有侵袭的可能,肿瘤组织多为向肠腔内生长,境界清晰,中心可见坏死病变和囊腔。结肠的胃肠道间质瘤的发病率最低,通常是小肠或胃部的恶性间质瘤瘤体转移到结肠,一般结肠的间质瘤同上,损伤结肠壁,向腹腔蔓延。食管的胃肠道间质瘤占整个胃肠道间质瘤的1/4,患病年龄中位数是63岁,通常恶性程度高,食管的胃肠道间质瘤要与食管的其他病变鉴别,小型的食管肿物,多为食管平滑肌瘤,如果肿瘤体积较大,要与晚期食管癌和淋巴瘤或者纵膈肿瘤侵犯食管鉴别。胃肠道间质瘤转移以肝脏转移最常见,转移灶CT扫描,可呈低密度,也可呈等密度,转移灶的坏死病变较多,但是坏死后很少出血,如果胃肠道间质瘤出现转移,多表现为全腹部多发性肿块,病变一般较小,境界清楚,一般不出现肠系膜的侵润和牵拉。胃肠道间质瘤淋巴结转移很少见,因此如果在肿瘤组织周围间淋巴结肿大,则胃肠道间质瘤的可能性不大,胃肠道间质瘤肺转移很少见,因此,胃肠道间质瘤一般是沿着静脉转移,这个特征也是胃肠道间质瘤与平滑肌肉瘤的主要不同之处。从病理组织学上看,瘤细胞狭长,呈波浪状,胞浆略嗜酸性,细胞界限不清,核梭形,两端细。胃肠道间质细胞瘤最具特征的标记物是CD117,主要应用免疫组织化学的方法即可检测,还有部分胃肠道间质细胞瘤还可以表达CD34,正常胃肠道肌层内CAJAL细胞核肥大细胞CD117阳性,而平滑肌细胞、血管平滑肌细胞核神经纤维不表达CD117。胃肠道间质瘤细胞起源于胃肠壁肌层的卡哈尔间质细胞,其主要作用是胃肠道神经丛节律起搏细胞。电镜下,瘤细胞表面有较多树突状突起,胞浆内有少量细丝和神经内分泌颗粒,与CAJAL细胞相似。通常胃肠道间质细胞瘤在胃部直径大于5.5cm,在肠部大于4cm,核分裂现象在胃部大于5/50HPE,在肠道大于1/50 HPE,肿瘤表现为坏死样外观,核异型性明显,肿瘤细胞丰富,生长活跃,上皮样细胞呈细胞巢或腺泡样排列一般恶性化程度高,但现今尚无有效的指标能有预测胃肠道间质细胞瘤的转移和恶化行为,有些专家推荐使用肿瘤的大小和核分裂作为转移的危险性评估指标,但是方法尚不可靠。胃肠道间质细胞瘤长期以来一直被诊断为平滑肌肉瘤或恶性神经鞘瘤,随着免疫组织化学、电子显微镜和分子生物学技术的发展,发现该肿瘤存在C-kit基因突变及蛋白表达,才有突破新进展,组织学上多有未分化或多功的梭形细胞或上皮样细胞组成。间质瘤在性质上与其他肿瘤不甚相同,从其生物学性质上可分为良性、交界性和恶性肿瘤。胃肠道间质瘤恶性的表现主要是肿瘤具有浸润侵蚀性,常常在基层侵润或粘膜层侵润,或者发现肿瘤有远处脏器和淋巴结转移。潜在的恶性的指标有肿瘤直径大于5cm,核分裂相大于5/50hpf,肿瘤组织内出现坏死,肿瘤细胞有明显的核异型性。我们通常应用以下依据来判定胃肠道间质瘤的良恶性,具备恶性指标1项或2项以上潜在恶性指标诊断为恶性胃肠道间质瘤,如果仅仅有一项潜在的恶性指标为交界性胃肠道间质瘤,如果没有上述指标即可诊断为良性。胃肠道平滑肌瘤与间质瘤的区别主要有：胃肠道平滑肌瘤一般发病年龄较轻,瘤细胞较稀少,形态单一,A-Mat(+),CD 117(-),CD34(-),无C-KIT基因突变,而胃肠道间质瘤一般发病年龄大,瘤细胞形态多变,排列结构多样,A-Mat(-),CD 117(+),CD34(+),有C-KIT基因突变。胃肠道间质瘤目前主要临床治疗方法,以外科治疗为主,由于微创技术的发展,内镜下ESD的剥离越来越让到广大患者接受。完整切除是手术疗效提高的表现,在手术中无瘤操作,并在术中要防止肿瘤破溃,术后复发或不能手术的病人一般可以选择肿瘤分子靶向药物的治疗。胃肠道间质瘤的大小其直径可以从1-2cm大到20cm,一般呈局限性生长,多数肿瘤没有完整的包膜,有时具有假包膜,恶性化程度高,有时伴有坏死局灶性出血和肿瘤组织破裂,有时可以穿破粘膜层导致消化道溃疡。消化道间质瘤一般见于粘膜下层,通常占整个间质瘤的百分之六十,比例最少的是局限于肌层,仅仅占整个胃肠道间质瘤的十分之一。一般胃肠道间质瘤外形呈息肉状,息肉常伴有溃疡,多向胃肠道腔内生长,向浆膜层生长一般形成浆膜下肿瘤。位于腹腔内的间质细胞瘤肿块一般体积较大,粘膜面一般有溃疡形成,可有出血、坏死粘液和囊性变等等,切开肿瘤呈结节状或分叶状,切面呈红色或灰白色,内部坚硬。手术切除是唯一可以治愈早期胃肠道间质瘤的方式,一般可以做局部切除和楔形切除,一般切除的范围要大于肿瘤包膜外2厘米,胃肠道间质瘤高危患者手术后复发率较高,据相关报道,复发率可以到达80-91%,约85%的患者在手术后2-3年可以复发,通常复发的过程还伴有肝脏的转移,一旦复发,其再治疗的可能性就很低,据相关研究,即便再次手术切除,也很难提高患者的生存率,如果胃肠道间质瘤发现较早,包膜完整没有转移,其手术切除后5年生存率达到一半,如果切除时包膜不完整,向粘膜层侵袭,或者切除不彻底,其手术切除后5年生存率小于35%,不能切除者总生存时间为一年。伊马替尼为蛋白络氨酸激酶小分子抑制剂,而络氨酸激酶能催化底物磷酸化,在细胞内传递信号,激发细胞增殖,络氨酸激酶的活性部位均有ATP结合口袋,络氨酸激酶的活性即是通过催化ATP转移磷酸基团到底物的络氨酸残基上,也就是通常所说的激酶的磷酸化。伊马替尼第一个适应症是慢性粒细胞性白血病,而第二个适应症是胃肠道间质瘤。伊马替尼能够选择性的使PDGERA受体络氨酸激酶抑制,对于胃肠道间质瘤中晚期或者手术不能治疗,或存在恶性转移危险的患者的预防性治疗,对于提高患者的预后和延长生存时间具有重要的意义。伊马替尼耐药主要是由于胃肠道间质细胞瘤表达野生型的KIT或者是外显子9突变,其主要机制是突变导致KIT结构的稳定,阻止了其与伊马替尼的结合。伊马替尼作为选择性KITPDGFRA受体络氨酸激酶抑制剂,主要应用于不能手术切除,或者切除后转移的病例,或者是切除后复发的病患,或者是完整切除后预防性的治疗,以防止胃肠道间质瘤的复发。通常,如果手术治疗后发现以下现象则高度怀疑复发,首先是在切除部位或者是原发灶又发现新的肿瘤组织,或者是原发灶的周围出现远处转移,或者是患者正在实施伊马替尼治疗的过程中发现肿瘤灶还在逐渐增大,影像学诊断发现,原发灶密度增高。如果能够直接进行手术治疗的,要尽早手术切除,如果不能进行手术治疗的,要先行伊马替尼治疗后如果可能再行手术治疗。有研究表明,手术联合伊马替尼及化疗药物联合治疗可以显著的提高胃肠道间质细胞瘤的预后。但是在伊马替尼治疗过程中,胃肠道间质瘤的耐药率较高,甚至高到70%,有些患者表现为治疗之初就耐药,一般发生率为20%,通常伊马替尼在连续性用药治疗胃肠道间质瘤半年后发现肿瘤继续生长,而且呈多病灶生长,一般患者耐药其基因型多表现为GIST野生型KIT的外显子9突变；继发性耐药现在学术界主要的观点是突变导致KIT的稳定,KIT的稳定阻滞了KIT结构域与伊马替尼的结合,还有其他突变的部位是外显子12、14和17。miRNA最早是在1993年由LEE在线虫中发现了长约22nt的非编码单链小RNA-lin-4,该实验首次发现由不编码蛋白质的单链小分子RNA能够调控生物体发育的过程,后来将该小分子RNA命名为miRNA,2000年有学者又在线虫中发现了另外一个miRNA基因称异时开关基因let-7,发现其主要功能是控制线虫向成虫生长,2002年,CALIN在临床慢性淋巴细胞白血病患者血液中发现miRNA部分缺失或者表达下降,2005年,有研究发现miRNA与某些肿瘤的发生相关,也有发现miRNA与特定的靶基因例如MiR15/16h和let-7作用对于癌症的发生发展发挥重要的作用,研制新的癌症药物基因靶点具有重要的意义和价值。miRNA分子链较小,一般为19-25个核苷酸分子的单链小RNA分子,成熟的miRNA的5’端有磷酸基团,3’端为羟基,miRNA主要在DNA的修复过程中抑制或组织正常细胞DNA修复产生致癌作用,同时抑制或阻止癌细胞DNA修复达到治疗的效果。miRNA基因序列和位置高度保守,表达和结构多样性,可以作为mRNA的调节因子,主要对细胞发育、细胞凋亡、细胞分化及细胞增殖起到调节作用,同时与应激反应、病毒感染、脂肪代谢及癌症和心血管疾病均有相关性,人类基因组中有一半以上的已知miRNA成簇表达,其表达彼此相关。miRNA分子序列短小,其基因组中存在较多的互补序列,在不同的生物体内与靶基因结合的方式也不一样,一般与多种蛋白结合,至今,miRBase公布miRNA的总数大约为3200余种,一般现阶段miRNA的检测主要通过基因克隆或者生物学筛选所得。miRNA对于癌症相关的作用主要表现在,影响癌基因的表达,主要是通过let-7miRNA调节RAS蛋白的表达水平,其次,通过研究慢性淋巴细胞性白血病发现,miR-15/16靶向调节BCL2而诱导肿瘤细胞的凋亡,再次,通过C-myc在激活E2F1介导的转录同时,通过miR-17/20也减少E2F1的表达,最后,有研究报道可以通过miRNA表达谱用于人类肿瘤的分类,miRNA作为肿瘤的分类依据,不但能够显示区分正常和肿瘤,还可以进一步区分不同的肿瘤组织类型和正常组织类型。miRNA的检测方法是对miRNA在生物细胞调控作用研究的关键和基础,如何快速、准确的定量检测miRNA是揭示细胞生长、凋亡、死亡或者异常生长的关键。通常的方法是Northern blotting法,全部的生物信息学分析都是需要Northern blotting法来验证和确认。但该方法灵敏度低,检测效率低。RT-PCR或者称为反转录PCR法也可以检测miRNA前体的表达含量,但前体的表达与成熟miRNA的表达往往水平不等,实时荧光定量PCR能够较为精确的定量分析miRNA的表达,通常可以通过延生引物的方法,在5’端进行标记,可以定量的测量丰度较低的RNA的含量。原位杂交技术可以确定miRNA的空间结构及表达的差异。但近期的研究我们也发现,新的miRNA发现频率越来越高,但是miRNA的功能研究相对缓慢,主要是由于miRNA作用靶点难以确认。大量的研究发现癌症组织存在异常的miRNA, miRNA在癌症的发生发展过程中起到特定的调节作用,尤其是在抑制某类蛋白质表达方面起到重要的作用。研究miRNA对于癌症的治疗具有重大意义。尤其是近年来发现,癌症的发生与某些蛋白关系密切,这类蛋白能激活癌基因,因此miRNA与蛋白质的结构域相关,目前RNAi技术可以在体外培养细胞中沉默内源性基因,利用RNAi技术降低恶性癌症细胞中癌基因成为肿瘤药物治疗的新的思路。因此,未来如果能够进一步深入的研究miRNA在生物发育中的作用,揭示其基因表达调控机制和生命发展过程,并通过对肿瘤发生发展中作用机制的研究,为进一步认识肿瘤的起因,为肿瘤的诊断和靶向治疗奠定基础。近年来对于miRNA-21与癌症的研究较多,大量的实时荧光PCR实验或者免疫印迹实验发现,miRNA-21在多种癌症组织或细胞中阳性表达,主要包括神经胶质细胞瘤,消化系统肿瘤(胃癌,食管癌,胆管癌,肝癌、口腔癌)生殖系统癌症(卵巢癌、宫颈癌)等等。如上所说miRNA-21的致癌机制尚不清楚,主要是由于其作用靶点难以确认,但近年来随着利用Northern blotting法,全部的生物信息学分析技术的深入研究,现主要发现miRNA-21靶基因主要有33个的位点,其主要的位点有PTEN,主要的作用是抑制细胞迁移。增殖等,NFTB,主要发挥转录抑制因子作用,STAT3,调控转录,细胞运动等。APAF-1,调控细胞凋亡等。以上因子都是确认由miRNA-21直接的靶基因,以上因子的动态变化都受miRNA-21的直接调控。但是也有一些不是miRNA-21的直接靶基因,但也受miRNA-21的调控,例如,BCL-2和TIMP3等,他们往往通过别的介导因子从而受miRNA-21的调控。以上因子的调控虽然都与miRNA-21相关,但是许多过程也不仅仅和miRNA-21相关,是1miRNA-21协同其他miRNA共同作用调控,因此,miRNA-21的调控过程是较为复杂的网络结构,有学者研究对酒精敏感的靶基因,发现JAG-1是miRNA-153, miRNA-335和miRNA-21共同的基因靶点,单独敲除其中的一项,都不会影响神经细胞对酒精的敏感性。miRNA-21的表达过程通常是在细胞核内由RNA聚合酶生成转录前体,通过加工成发卡结构转运到细胞质,最后剪切成熟。上个世纪八十年代末,由日本人十本等首先从非霍其金淋巴瘤细胞染色体中分离出Bcl-2基因,而该基因的存在与Bcl-2蛋白的表达相关。Bcl-2蛋白大小为26KD,其中含有BH4同源结构,该结构与抗凋亡蛋白的结构类似,BH3结构与其他促凋亡的蛋白结构类似,因此Bcl-2蛋白的作用与其两个同源结构的比例相关,抗凋亡结构的比例高,Bcl-2蛋白就呈现抗凋亡的作用,反之亦然。Bcl-2主要存在于线粒体外膜,核膜和内质网膜上。Bcl-2蛋白家族分为两类,一类是抗凋亡蛋白,例如Bcl-XL, Bcl-W,A1等,另一类促凋亡的蛋白有BAX,BAK等。通常Bcl-2家族分为三大类,抗凋亡的Bcl-2蛋白主要结构中包含BH1/BH2/BH3/BH4等,直接或间接抑制细胞死亡,促凋亡蛋白BAX,BAK,其结构中主要含有BH1/BH2/BH3,具有促进细胞凋亡,抑制癌细胞生成的作用。BH3-only,其主要的功能为增敏剂和诱导剂的作用,既可以促进凋亡作用,又可以促进抑制凋亡的作用。Bcl-2的抑制凋亡作用主要有五个通路,分别为维持细胞钙的稳定状态,阻止线粒体膜电位下降；抑制促凋亡BAX/BAK的细胞毒性作用,维持二者的稳定性,阻止其二聚体的形成。保护线粒体膜的功能抑制线粒体释放细胞色素C、AIF等促凋亡蛋白的释放,同时可以减少细胞氧化和氧化物的形成。而以上的分析说明,对于miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤样本的表达情况尚未有相关报道,探索miRNA-21的表达与伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤临床病理特征的相关性尚未有相关研究,探索研究的miRNA-21与Bcl-2在胃肠道间质细胞瘤的相互关系及作用机制,为进一步研究miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤中的作用基因靶点提供新的实验证据,而胃肠道间质细胞瘤的发生、发展均较为隐匿,药物治疗效果不很理想,因此,临床急需对于胃肠道间质细胞瘤相关发生发展机制进行深入研究,为开发靶向治疗药物,提高其治疗效果,减少病患痛苦提供新的思路和方法。目的本文预通过研究miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤样本的表达情况,探索miRNA-21的表达与伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤临床病理特征的相关性,为寻找伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤治疗新的药物靶点提供有效的基础实验研究,我们又进一步研究的miRNA-21与Bcl-2在胃肠道间质细胞瘤的相互关系及作用机制,为进一步研究miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤中的作用基因靶点提供新的实验证据,其研究成果可以直接应用到胃肠道间质细胞瘤药物开发和临床治疗,无论是对于提高胃肠道间质细胞瘤的治疗效果,降低其患者医疗花费和社会家庭的负担均具有重大意义。为其相关miRNA-21与Bcl-2靶点的抗癌药物的开发在临床应用的进一步推广提供科学依据。方法1.胃肠道间质瘤组织样本获取,胃肠道间质瘤T1细胞培养我们收集了2013年10月至2015年10月期间,在内蒙古医科大学附属医院及广州南方医科大学南方医院就诊并诊断为胃肠道间质瘤的患者31例,整个实验过程均经内蒙古医科大学附属医院及广州南方医科大学南方医院伦理委员会审核通过,全部患者在进行标本获取前均签署知情同意书,收集的病例标本我们统计了病患的性别、年龄、临床表现、肿瘤位置,大小及其病理分型。于Cosmo Bio Co. Ltd (Tokyo, Japan)公司购买胃肠道间质瘤T1细胞,细胞用DMEM配方其主要组成为细胞溶液中添加10%的胎牛血清,1% v/v的青霉素和1%v/v的链霉素(Ameresco, Framingham, MA, USA).将细胞种植在培养瓶中,在5% CO2、370C的加湿培养箱中进行培养。将浓度为85%的胃肠道间质瘤T1细胞在加有2%小牛血清和5uM的伊马替尼(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的DMEM培养液中共培养,培养的细胞作为伊马替尼药物干扰细胞组。我们利用Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)试剂盒转染生成含有非特异靶标miRNA和含有miRNA-21的85%胃肠道间质瘤细胞,并在DMEM培养液中共培养。2.RNA的提取与定量测量利用TRIzol试剂盒(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)从胃肠道间质瘤细胞,正常胃组织作为照组组标本中提取总mRNA,并滴加核糖核酸酶抑制剂SUPERase·InTM(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)lul,通过RT-qPCR对目标基因进行扩增,42℃C,5 min,接着95℃,10秒钟逆转录,95℃,5秒,60 ℃,20秒,共40个循环。用Takara One Step RT-PCT kit (Takara, Tokyo, Japan)试剂盒定量分析Bcl-2 mRNA和miRNA-21的含量。胃肠道间质瘤细胞的miRNA用miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX,USA)试剂盒进行提取,利用1nirVanaTM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)试剂盒和Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR仪对miRNA-21的表达进行定量测量,Bcl-2 or miRNA-21倍数变化以β-actin orU6为内参采用△△Ct= ACt(stimulus)-ACt(solvent), ACt= Ct (target gene)-Ct(contol gene)公式进行计算,基础表达水平利用2-(△Ct)公式进行计算3.荧光素酶印迹实验我们用荧光素酶把载体插入三个相同的miRNA-21的靶位点Bcl-2基因3’UTR位点,利用脂质体2000将Bcl-2位点和Bcl-2mut位点转染到浓度为85%胃肠道间质瘤细胞,同时将30和60 nM miRNA-21和对照小RNA进行转染,转染共培养24小时后利用双荧光素试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)进行检测实验。4.细胞增殖实验、MTT比色法和细胞凋亡实验胃肠道间质瘤T1细胞种植在12孔细胞培养板,每个孔有300个细胞,12小时后培养板分为两组,第一组加入0 μM伊马替尼,第二组加入5μM伊马替尼,并且将60 nM非特异靶标miRNA和miRNA-21对细胞进行转染,转染后将细胞培养于37摄氏度5%C02箱中96个小时,(0.005%)结晶紫染色胃肠道间质瘤细胞30分钟,记录克隆数量。用MTT比色法主要检测处理后的胃肠道间质瘤细胞活力,其过程简单描述如下,将胃肠道间质瘤细胞种植于96孔培养板上,12小时后培养板分为两组,第一组加入0μM伊马替尼,第二组加入5 μM伊马替尼,并且将60 nM非特异靶标miRNA和miRNA-21对细胞进行转染,转染后将细胞培养于37摄氏度5%C02箱中48个小时,细胞培养液换成MTT溶液在37摄氏度培养2小时,在分光光度计上在450nm的光波下测量其光密度。细胞活性主要测量胃肠道间质瘤细胞和对照组细胞活性相对比值,用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abeam, Cambridge, UK)试剂盒对胃肠道间质瘤细胞进行染色,通过流式细胞仪检测胃肠道间质瘤细胞在伊马替尼处理miRNA转染后细胞凋亡水平结果1.胃肠道间质瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的含量及两者的相关性分析我们分析比较了全部31例胃肠道间质瘤病例特征(表1示),在胃肠道间质瘤细胞内,定量测量了miRNA-21和Bcl-2表达,其中miRNA-21/U6相对量为0.6729±0.07632,其含量显著低于正常胃组织细胞的含量(1.0000±0.1085)差异具有统计学意义(p=0.0129),而Bcl-2 mRNA水平在胃肠道间质瘤组中(1.500±0.1484)显著性高于正常胃组织细胞的含量(1.0000±0.1085)(p=0.0103),差异具有统计学意义。接着比较了miRNA-21和Bcl-2 mRNA之间的相关性,我们发现miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈显著性负相关关系,(R2=0.2450,p=0.0046),总之,在胃肠道间质瘤细胞中,miRNA-21水平下调,Bcl-2上调,两者呈显著性负相关。2.在胃肠道间质瘤中iRNA-21的作用位点Bcl-2的3’端非编码区与Bcl-2上调的机制的关系为了进一步研究在胃肠道间质瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的相关性及Bcl-2上调的机制,我们通过对胃肠道间质瘤-TI细胞转染miRNA-21 mimics,然后测量Bcl-2的表达。表2显示,与转染miRNA相比,转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞miRNA-21水平显著上调(p<0.001 or p<0.0001 for 30or 60 nM),而与miRNA-21相反,Bcl-2 mRNA的水平在转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞显著性下调,(p<0.05 or p<0.01 for the 30 or 60 nM,).同样,我们在蛋白水平也证实了Bcl-2蛋白在转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞显著性下调(p<0.05 or p<0.01).为了证实否是由于miRNA-21作用于Bcl-2的3’非编码区,而使Bcl-2的下调,我们在转染miRNA-21 mimics和转染对照miRNA的胃肠间质瘤细胞进行比较,采用了荧光素酶活性检测来研究Bcl-2的3’非编码区质粒报告和单纯Bcl-2的3’非编码区报告,图3为质粒报告和Bcl-2mut报告结构流程图,荧光素酶报告显示,与对照组转染RNA的胃肠间质瘤细胞比较,转染30和60 nMmiRNA-21 mimics的胃肠间质瘤细胞荧光素酶活性显著降低(p<0.001 for 30 or 60nM),而Bcl-2mut报告miRNA-21 mimics并无降低荧光素酶,以上研究证实了在胃肠间质瘤细胞中,miRNA-21作用于Bcl-2的3’非编码区,而使Bcl-2的下调。3.miRNA-21可以使胃肠道间质瘤细胞对伊马替尼敏感我们采用克隆实验进一步验证胃肠道间质瘤细胞中miRNA-21是否能使细胞对伊马替尼治疗敏感,5 μM伊马替尼显著降低胃肠道间质瘤细胞克隆(p<0.01),同样,与对照组转染miR的胃肠道间质瘤细胞比较,5μM伊马替尼显著降低转染60 nM miR-21 mimics胃肠道间质瘤细胞克隆(p<0.001,p<0.05).,同时,我们检测了转染60 nM miR-21 mimics和miR Control对照的并用伊马替尼处理的胃肠道间质瘤细胞的活性和细胞凋亡率,转染60 nM miR-21 mimics和miR Control对照的并用胃肠道间质瘤细胞细胞活性无差异,而转染60nM miR-21 mimics和miR Control对照的并用5μM伊马替尼处理24或48小时候,胃肠道间质瘤细胞细胞活性显著性降低。(p<0.05 or p<0.01),转染60 nMmiR-21 mimics并用伊马替尼处理的胃肠道间质瘤细胞下降的幅度比miR对照更大(p<0.05伊马替尼处理24小时或48小时),同时我们检测到伊马替尼诱导转染60 nM miR-21 mimics胃肠道间质瘤细胞的凋亡,(p<0.05伊马替尼处理24小时或48小时),因此,miRNA-21可使胃肠道间质瘤细胞对伊马替尼药物的敏感性增强。结论1、我们成功的培养了胃肠道间质瘤细胞T1的模型,为进一步研究胃肠道间质瘤细胞的特性奠定了基础。2、miRNA-21在胃肠道间质瘤细胞内表达较正常胃粘膜细胞降低,而Bcl-2mRNA和Bcl-2蛋白在胃肠道间质瘤细胞内比正常胃粘膜细胞增高,miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈显著性负相关关系。3、转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞miRNA-21水平显著上调,而Bcl-2 mRNA的水平在转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞显著性下调,在蛋白水平也证实了Bcl-2蛋白在转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞显著性下调。4、在胃肠间质瘤细胞中,miRNA-21作用于Bcl-2的3’非编码区,而使Bcl-2的下调。5、伊马替尼显著降低胃肠道间质瘤细胞克隆。6、伊马替尼显著降低转染miR-21 mimics胃肠道间质瘤细胞克隆。7、转染miR-21 mimics和miR Control对照的并用胃肠道间质瘤细胞细胞活性无差异,而转染miR-21 mimics和niR Control对照的并用伊马替尼处理可以使胃肠道间质瘤细胞细胞活性显著性降低。因此本文通过研究miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤样本的表达情况,探索miRNA-21的表达与伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤临床病理特征的相关性,为寻找伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤治疗新的药物靶点提供有效的基础实验研究,同时我们发现miRNA-21与Bcl-2在胃肠道间质瘤中的表现显著性负相关,miRNA-21通过作用于Bcl-2的3’非编码区使其下调,并且miRNA-21可提高胃肠道间质瘤细胞对伊马替尼的敏感性。本研究其研究成果可以直接应用到胃肠道间质细胞瘤药物开发和临床治疗,无论是对于提高胃肠道间质细胞瘤的治疗效果,降低其患者医疗花费和社会家庭的负担均具有重大意义。